摘要 
目的　研究金雀异黄素影响生长因子(KGF 和EGF) 对HPV 16型DNA-永生化人宫颈角质细胞(HCE 16/3细胞) 的生长调节。 
方法　使用[ 3H ]-胸苷掺入试验, uPA 分泌的检测和酪氨酸蛋白激酶试验, 分析金雀异黄素影响生长因子对培养的HCE 16/3 细胞的生长调节。 
结果　在无血清培养的条件下, 生长因子刺激HCE 16/3细胞的生长, 但金雀异黄素不仅抑制生长因子对HCE 16/3细胞的生长刺激, 而且抑制KGF 对HCE 16/3细胞uPA 分泌的刺激作用, 这种抑制效应可能与它抑制生长因子受体的酪氨酸蛋白激酶活性有关。 
结论　金雀异黄素对人体内某些肿瘤具有潜在的防治价值。 
主题词　金雀异黄素　　生长因子　　上皮细胞　　酪氨酸激酶

流行病学研究已显示, 增加豆类食品饮食可以降低某些激素依赖的肿瘤发生[1 ]。食品分析证明, 豆类食品含丰富的异黄酮金雀异黄素(genistein) , 它可能是豆类食品降低某些激素依赖的肿瘤发生的主要成分之一。它能通过竞争性的结合雌激素受体而干扰雌激素功能[2 ]。角质细胞生长因子(KGF) 是间质细胞分泌的特异性作用上皮细胞的生长因子。按氨基酸序列的同源性, 属于成纤维细胞生长因子(FGF) 家族, 又称FGF-7[3 ]。HCE 16/3细胞是HPV 16型DNA 永生化的人宫颈角质细胞, 它是一种稳定生长的细胞株, 但不具备停泊独立生长和致瘤性。KGF 已显示能刺激HCE16/3 细胞生长和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA ) 的分泌,但抑制病毒早期基因表达[4, 5 ]。已往的研究结果已证明, 金雀异黄素是一种特异性的酪氨酸蛋白激酶抑制剂[6 ] , 它的抗增生作用与抑制酪氨酸蛋白激酶和拓扑酶活性有关。但金雀异黄素对KGF 和表皮生长因子(EGF) 调节HCE16/3细胞生长尚属未知。本实验结果显示, 金雀异黄素能抑制生长因子对HCE16/3细胞的生长刺激作用, 这种生长抑制作用与降低生长因子诱导的酪氨酸蛋白激酶活性有关。 
材料与方法 
1.细胞培养: HCE16/3细胞生长于1: 1混合的DM E 和Ham’s F12, 外加2% 灭活的胎牛血清、2mmol/L -谷酰胺、5μg/ m l 胰岛素、5μg /m l 转铁蛋白、400ng/m l 氢化考的松、0.1nmo l/L 霍乱毒素、5ng/m l EGF 和抗菌素[4 ]。杂交试验显示细胞无支原体污染(M ycop lasmaTC; Gen-P robe, 美国)。SiHa 细胞(HPV 16型DNA 阳性的人宫颈鳞状细胞癌细胞株) 生长于DM E, 外加10% 灭活的胎牛血清, 2mmo/L -谷酰胺和抗生素。 
2.生长因子及试剂: KGF 购自Pepro tech EC L td (英国) , EGF 购自Sigma, 分散因子( scat ter factor, SF ) 由Water Birchmeier 和Martin Sachs 惠赠, 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 由Andreas Sommer 惠赠。金雀异黄素由O lli Silvennoinen 惠赠, 以20 mg/m l 溶于DMSO。 
3.细胞生长试验: HCE16/3细胞生长于24孔培养板, 当细胞生长汇合后, 换不含血清和上述5种细胞生长添加剂的培养液(称DF 培养液) 培养24小时, 然后加生长因子和金雀异黄素。16小时后细胞用18.51 kBq/m l 的[ 3H ]2胸苷(962 GBq/mmo l, amersham ) 标记4小时, 然后用冷PBS 洗3次, 95% 甲醇于4℃固定90分钟后用冷PBS 再洗一次。细胞核DNA 以0.8 m l、0.2 mol/L N aOH 抽提, 抽提液加4ml液闪液(opti-Fluor®packard instrumen t company) , 混匀后用液闪仪测掺入的[3H ]-TdR 值。每一样本一式两份。 
4.uPA 酶联免疫吸附试验(ELISA ) 分析:HCE16/3细胞生长于24孔培养板, 当细胞生长到85%～ 90% 汇合时, 换DF 培养液培养24小时, 然后换0.5ml 新鲜的DF 培养液并加生长因子和金雀异黄素, 37℃二氧化碳培养箱培养。4和8小时后, 培养液收集到Eppendorf 管, 瞬时离心除去细胞碎片后, 上清液收集到新的Ep-pendo rf 管供uPA ELISA 分析。ELISA 分析方法按文献[ 5 ]所述进行。 
5.酪氨酸蛋白激酶试验: HCE16/3和SiHa细胞生长于60 mm 培养皿。当细胞生长到85%～ 90% 汇合时, 换不含血清(HCE16/3用DF 培养液) 培养液, 24小时后加生长因子(图3) , 37℃二氧化碳培养箱培养10分钟。然后用冷PBS 洗一次, 加250μl Laemm li 样本缓冲液, 收集溶解的细胞到Eppendo rf 管。样本95℃变性5分钟后, 蛋白质用7.5% SDS-PA GE 分离。分离后的蛋白质转至硝化纤维素膜上, 用抗磷酸化酪氨酸蛋白抗体检测。免疫反应用ECL western blotting system (Amersham ) 方法显带。为了检测金雀异黄素对生长因子诱导HCE 16/3细胞酪氨酸蛋白激酶活性的影响, 细胞培养液先加金雀异黄素, 25分钟后再加50 ng/m l KGF或EGF (图4)。其余步骤同前。 
结果 
1.金雀异黄素减弱生长因子对HCE 16/3细胞的生长刺激作用: 如图1所示, 在无血清培养的条件下, 生长因子明显刺激HCE 16/3 细胞的生长, 这与以往的试验结果[4 ]一致。但这种刺激作用可被金雀异黄素所减弱, 15μg/m l 和30μg/m l 金雀异黄素抑制KGF 对HCE 16/3细胞生长的刺激作用分别为30% 和50% , EGF分别为40% 和45% (图1)。在同样培养条件下,15μg/m l 和30μg/m l 金雀异黄素并不明显影响HCE16/3细胞的生长, 这可能与培养液缺乏金雀异黄素所能干扰的刺激信号有关。 
2.金雀异黄素抑制KGF 对HCE 16/3 细胞uPA 生成的刺激作用: 本研究和先前的工作已证明, KGF 能刺激HCE16/3 细胞uPA 生成[5 ]。为了确定金雀异黄素是否也影响KGF 对HCE16/3 细胞生成uPA 的调节, EL ISA 被用于此项检测。结果显示, 金雀异黄素抑制KGF对HCE16/3细胞生成uPA 的刺激作用(图2) ,这种抑制作用在4小时阶段特别明显, 而且呈剂量依赖关系(图2A )。30μg/m l 金雀异黄素能抑制KGF 对HCE16/3 细胞uPA 生成的刺激达40% , 60μg/m l 基本上可以抵消KGF 对HCE16/3 细胞生成uPA 的刺激作用, 100μg/m l已显示出细胞毒性。 
3.金雀异黄素抑制生长因子诱导的酪氨酸激酶活性: HCE16/3 细胞在无血清培养的条件下, 除了固有的自身磷酸化酪氨酸蛋白外,KGF 还诱导一新的磷酸化酪氨酸蛋白, 分子量为50000; EGF 诱导三条新的磷酸化酪氨酸蛋白带, 分子量分别约为55000, 46000和37000,此外它还增强某些原有的自身磷酸化酪氨酸蛋白带的强度。SF 和bFGF 未见诱导任何新的磷酸化酪氨酸蛋白。EGF 除了可增强SiHa 细胞某些原有的自身磷酸化酪氨酸蛋白带的强度外, 还可诱导两条新的磷酸化酪氨酸蛋白带, 分子量分别约为55000和31000。KGF 不影响Si-Ha 细胞酪氨酸激酶活性, 这说明SiHa 细胞缺乏KGF 的受体(图3)。 
对于KGF, 15μg/m l 和30μg/m l 金雀异黄素并不改变其对HCE16/3细胞的酪氨酸激酶活性, 但60μg/m l 金雀异黄素可明显抑制KGF 对该细胞酪氨酸激酶活性影响。它除了抑制KGF 特异诱导的50000磷酸化酪氨酸蛋白外, 还抑制其它细胞自身磷酸化酪氨酸蛋白水平(图4)。对于EGF, 30μg/ml 金雀异黄素便可明显抑制其诱导HCE16/3细胞的酪氨酸激酶活性(图4)。 
讨论 
许多生长因子(如EGF, KGF, bFGF, SF, 血小板衍生的生长因子和胰岛素样生长因子-I) 的受体都含有胞浆内酪氨酸激酶结构域。生长因子对靶细胞的生长调节, 是通过结合到胞外特异性受体, 通过跨膜结构域, 激活胞浆内的酪氨酸激酶结构域, 从而导致下游信号系统的激活。本实验结果显示, KGF 和EGF 能特异诱导HCE16/3 细胞的酪氨酸激酶活性, 但bFGF和SF 未能显示影响该细胞酪氨酸的磷酸化。这可能系HCE16/3 细胞缺乏bFGF 和SF 受体, 或受体含量太低, 以至于不足以被bFGF 和SF 激活。另一种可能是bFGF 和SF 缺乏有效的生物学活性。EGF 除了可诱导新的磷酸化酪氨酸蛋白外, 还可增强HCE16/3和SiHa 细胞原有磷酸化酪氨酸蛋白的强度, 提示HCE16/3和SiHa 细胞可能含有较高的EGF 受体, 或是细胞对EGF 的刺激信号反应增强。KGF 不影响SiHa 细胞酪氨酸激酶活性, 这与SiHa 细胞缺乏KGF 的受体是一致的[4 ]。 
金雀异黄素能显著抑制生长因子对HCE16/3细胞的生长刺激作用。但在缺乏生长因子的情况下, 金雀异黄素并不显示影响HCE16/3细胞的生长, 因此金雀异黄素抑制生长因子对HCE16/3细胞生长的刺激, 显然与它抑制生长因子诱导的刺激信号有关。KGF 和EGF 能特异性地诱导HCE16/3细胞的酪氨酸激酶活性, 这种新的磷酸化酪氨酸蛋白均可被金雀异黄素所抑制。值得注意的是, 金雀异黄素抑制KGF 诱导HCE16/3细胞的酪氨酸激酶活性与剂量有关。15μg/m l 和30μg/m l 金雀异黄素, 能显著抑制KGF 对HCE16/3 细胞生长的刺激作用, 但并不能抑制KGF 诱导HCE16/3细胞的酪氨酸激酶活性, 只有60μg/ml 金雀异黄素, 才显示出抑制KGF 对HCE16/3细胞酪氨酸激酶活性的影响。但30μg/m l 金雀异黄素却能明显抑制EGF 对HCE16/3细胞酪氨酸激酶活性影响。不同抑制反应的机理尚不清楚。根据本研究方法, [3H ]-TdR 掺入试验似乎比酪氨酸蛋白激酶试验更敏感。另一种可能, 金雀异黄素减弱生长因子对HCE16/3细胞的生长刺激作用, 是独立于它对酪氨酸激酶活性的影响[7 ]。 
除了可以抑制生长因子对HPV DNA 永生化人宫颈角质细胞的生长刺激外, 金雀异黄素还具有较广泛抑制其它细胞生长的能力。已往报道已显示, 它可以抑制EGF 对N IH3T 3细胞的刺激作用[8 ]。此外, 它还可抑制神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和尤文氏肉瘤细胞株的生长[7 ]。金雀异黄素对这些肿瘤细胞株生长的抑制, 与这些肿瘤细胞株产生含酪氨酸激酶的受体有关。金雀异黄素抑制生长因子诱导的酪氨酸激酶活性的机理, 与金雀异黄素能竞争性地抑制ATP 结合到酪氨酸激酶催化结构域有关。它的抗增生作用除了与抑制酪氨酸激酶有关外, 还与影响拓扑酶活性有关。拓扑酶已被证明涉及DNA 转录、复制和细胞有丝分裂。 
在无血清培养的条件下, 金雀异黄素显示抑制KGF 对HCE16/3 细胞uPA 生成的刺激作用。我们的工作曾证明, HCE16/3细胞能产生多量uPA , 并且该细胞uPA 的产生能被KGF 所刺激。金雀异黄素抑制KGF 对HCE16/3 细胞生成uPA 的刺激主要表现在4小时阶段, 而且呈剂量依赖关系。这种uPA 的分泌与细胞生长呈平行状态的结果, 与以往的实验结果[5 ]一致。因为uPA 活性在细胞迁移和肿瘤细胞浸润过程中起重要作用。金雀异黄素抑制生长因子对永生化的人宫颈角质细胞生长和uPA 分泌的刺激作用, 与它在体内可预防肿瘤的观察是一致的[9 ]。 

参考文献 
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