苏州大学, 2014.

背景：大豆异黄酮是富含于大豆中的植物雌激素,其中金雀异黄素(Genistein)生物活性最强。体内外研究均证实大豆异黄酮能减少激素依赖性肿瘤乳腺癌和前列腺癌发病率,是一种很有前景的防治癌症的天然化学物质。已知激素替代疗法有助于降低绝经女性结肠癌的发病风险,因此开展对植物雌激素的大豆异黄酮在结肠癌中的防治作用的研究具有重要的意义。另外,作为肿瘤的放射治疗在临床上可联合应用手术、化学或激素治疗,为了提高局部控制以及生存期,放疗联合放射增敏试剂是一种针对癌症的有效的治疗方法,大豆异黄酮在其中所起的作用也值得关注。

　　目的：研究大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的抗癌作用及大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的辐射增敏作用。

　　方法：细胞株选用人结肠癌细胞 HCT-116和乳腺癌细胞 MDA-MB-468,细胞于DMEM培养基中常规培养传代。除非特别交代,金雀异黄素的实验浓度定为0、25、50和100μmol/L。采用MTT法测定细胞存活率、流式细胞术分析细胞周期的分布、Western blot法测定相关蛋白的表达、磷脂酰丝氨酸外翻法(Annexin V-PI双染法)分析金雀异黄素对细胞凋亡的影响;细胞内ROS的影响(DCF法)和线粒体膜电位的变化(JC-1法)采用试剂盒检测;采用透射电镜下观察细胞超微结构的改变;金雀异黄素对肿瘤细胞的侵袭转移的影响,采用Transwell实验、细胞粘附性实验以及免疫荧光法测定E-钙粘附蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶(MMP2)的变化进行研究。金雀异黄素对肿瘤细胞放射敏感性的初步研究选用无毒性25μmol/L的金雀异黄素处理细胞,联合 X射线对细胞进行辐照。采用克隆形成实验计算细胞存活分数、流式细胞术检测细胞周期和细胞的凋亡、并用Western blot法进一步检测金雀异黄素预处理对照射后细胞内DNA损伤修复相关蛋白表达的调节作用。

　　结果：⑴金雀异黄素对HCT-116细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖关系,抑制50％细胞生长的剂量(IC50)为123.8μmol/L(24 h)。0、25、50和100μmol/L金雀异黄素处理后出现了明显的G2/M的周期阻滞,细胞数量从18.11±1.36％增至32.7±0.04％。进一步的机制研究发现,金雀异黄素处理降低了细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinH表达,对CylinD3、CyclinA、CyclinE的表达无明显影响。⑵金雀异黄素处理HCT-116细胞后,Annexin V/PI双染法结果显示早期凋亡细胞比例随浓度增加而上升,晚期凋亡细胞也略有增多。特征性的Sub-G1凋亡峰随处理浓度的增加而增多。100μmol/L金雀异黄素处理2 h后细胞内ROS水平达峰值,为处理前的1.81倍(15.53±1.55％vs8.57±0.35％),然后逐渐下降。100μmol/L金雀异黄素处理1h后线粒体膜电位迅速下降了87.8％,以后虽略有回升,但维持在极低的水平。与凋亡相关的P53蛋白出现升高,并且抑凋亡蛋白Bcl-2出现了下调,促凋亡蛋白 Bax出现了上调。透射电镜下,金雀异黄素处理后细胞呈现不同程度的凋亡和自噬性改变。⑶100μmol/L金雀异黄素处理8h后细胞粘附性为81.32±3.26％,对照组为97.31±7.68％,即金雀异黄素显著降低粘附能力。Transwell结果显示0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后转移细胞数分别为567.67±50、407±15.58、63.33±11.15,即侵袭转移能力逐步下降。荧光显微镜下100μmol/L金雀异黄素处理后细胞质中E-cadherin荧光强度变强,MMP2抗体荧光强度变弱。⑷金雀异黄素对MDA-MB-468细胞增殖也有明显的抑制作用并具有浓度和时间依赖关系,IC50为70.8μmol/L(24 h)。0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后G2/M期细胞数量从10.04±0.74％增至50.21±1.47％,100μmol/L时减至19.55±7.13％,表明低浓度时(<50μmol/L)引起G2/M期阻滞。⑸Annexin V/PI双染法分析显示100μmol/L金雀异黄素处理后晚期凋亡细胞有所增加。特征性的Sub-G1凋亡峰随着处理浓度的增加而增多。100μmol/L金雀异黄素处理后2 h,ROS水平是处理前的1.44倍(84.8±2.69％vs58.93±0.67％),然后逐渐下降。100μmol/L金雀异黄素处理1h后细胞线粒体膜电位迅速下降了93.7％(16.03±0.52％ vs1.01±0.20％, P<0.01),以后维持在极低的水平。透射电镜下,处理后细胞也呈现不同程度的凋亡性改变。⑹100μmol/L金雀异黄素处理6h后细胞粘附性为93.45±0.90％,显著低于对照组的99.21±0.58％。Transwell结果显示0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后转移细胞数分别为546.33±20.07、449.67±14.38、305.67±8.06,提示侵袭转移能力明显下降。荧光显微镜下,100μmol/L金雀异黄素处理后细胞质中 NF-κB抗体荧光强度稍变弱,细胞质中 E-cadherin抗体荧光强度变强、MMP2抗体荧光强度变弱。⑺在人结肠癌HCT-116细胞中,与单纯照射组6Gy组比较,25μmol/L金雀异黄素预处理照射联合组,能明显减少照射后的细胞克隆形成数,其放射增敏比为1.204。细胞周期的结果显示25μmol/L金雀异黄素与6Gy辐射联合后G2/M期细胞上升至35.74±3.25％,与单纯照射组26.26±2.19％相比有明显升高。特征性的Sub-G1凋亡峰,单纯照射组为:5.25±0.8％,联合组为10.89±0.24％。机制研究发现金雀异黄素与辐射联合较单纯照射组比 DNA损伤修复蛋白 Ku80、Mre11和XRCC4的表达出现了明显下调。⑻在乳腺癌MDA-MB-468细胞中,25μmol/L金雀异黄素与6Gy辐射联合组和6Gy照射组的G2/M期细胞分别为82.41±2.44％和24.08±2.87％,发现金雀异黄素预处理能够明显引起细胞G2/M期周期阻滞。特征性的Sub-G1凋亡峰,单纯照射组为:7.24±0.68％,联合组为13.3±0.74％。但是,在MDA-MB-468细胞的Ku80、XRCC4、Mre11蛋白水平无明显差异。

　　结论：①金雀异黄素能够抑制结肠癌HCT-116和乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖,并呈浓度依赖和时间依赖。金雀异黄素诱导了这两种肿瘤细胞的G2/M期周期阻滞。诱导细胞内ROS的产生,从而引起线粒体膜电位的降低诱导细胞凋亡。②其抗肿瘤的作用机制可能是金雀异黄素能够下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白 Bax等的表达诱导了细胞的凋亡,引起细胞周期蛋白的改变,诱导了细胞的G2/M期的周期阻滞。抑制肿瘤的侵袭及转移能力与调节钙粘附蛋白和基质金属蛋白酶有关。③金雀异黄素能够增加结肠癌 HCT-116和乳腺癌MDA-MB-468细胞的放射敏感性,金雀异黄素预处理细胞的凋亡和G2/M期有明显增加。其机制:在结肠癌HCT-116细胞中可能与调节DNA损伤修复蛋白有关,而在MDA-MB-468细胞中没有发现,这里可能与肿瘤细胞的类型有关,确切的机制尚需进一步研究。