Genistein对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及对cyclinB1、cyclinD1蛋白表达的影响

邹晓燕

中国医科大学硕士论文

 

卵巢癌在女性生殖器官恶性肿瘤中死亡率居首位，近年来，尽管化疗取得了重要进展，但5年生存率仍无明显提高，因此寻找治疗卵巢癌的新型药物及新型作用靶点已成为迫切的需要。

　　 Genistein又称染料木黄酮，最初是从大豆中提取出来的一种植物雌激素，作为酪氨酸蛋白激酶的特异性抑制剂，近年来国内外许多研究表明它可抑制乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等多种肿瘤的生长。我们的前期研究已证实，genistein对卵巢癌CAOV3细胞的增殖具有抑制作用。王心等通过胃灌注人卵巢癌裸鼠移植瘤模型20例的研究表明，genistein可通过抑制卵巢癌细胞增殖和微血管生成发挥抑瘤作用。本研究选用临床上常用的腹腔注射给药途径，探讨genistein对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及对细胞周期蛋白cyclinB1、cyclinD1表达的影响。

　　 材料和方法：

　　 一、材料

　　 1、研究对象

　　 人卵巢癌HO-8910细胞购自于上海生命科学院细胞资源中心。BALB/c遗传背景的、nu/nu雌性裸鼠作为实验动物，4-6周龄，体重18-22g，购自上海斯莱克实验动物中心，饲养于中国医科大学实验动物中心SPF级环境中。

　　 2、主要仪器

　　 超净工作台、二氧化碳培养箱、冰箱、倒置显微镜及照相系统、离心沉淀机、恒温振荡器、游标卡尺、电子分析天平、水平摇床、电泳仪、转印电泳槽、垂直板电泳装置、紫外分光光度计、凝胶电泳成像分析系统。

　　 3、主要试剂

　　 Genistein、DMEM培养基、DMSO、PBS缓冲液、胰蛋白酶、小牛血清、青霉素、链霉素、鼠抗人cyclinB1单克隆抗体、鼠抗人cyclinD1单克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗鼠第二抗体、碱性磷酸酶显色试剂盒、o-dianidine、β-naphthylacidphosphate、硝酸纤维素膜、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲醇。

　　 二、方法

　　 1、药品配置

　　 Genistein用二甲基亚砜（DMSO）配成储备液，置于-20℃保存。实验时用DMEM培养基稀释成所需浓度。

　　 2、细胞培养

　　 人卵巢癌HO-8910细胞在含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基中贴壁生长，于37℃、5％二氧化碳培养箱中传代培养。

　　 3、卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

　　 用DMEM加10％小牛血清培养人卵巢癌HO-8910细胞，细胞按1×107/mL悬浮于无血清培养基中，每只裸鼠右腋下皮下接种0.2mL，约7-10天可形成肉眼可见的瘤块，直至瘤块长至直径约5mm时开始腹腔给药。

　　 4、动物实验

　　 通过建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，探讨genistein对卵巢癌是否具有抑制作用。

　　 5、Westernblot法

　　 检测genistein对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤组织中cyclinB1、cyclinD1蛋白表达的影响。

　　 6、统计学方法

　　 应用统计学软件SPSS13.0对成组计量资料组间差异进行t检验，P<0.05差异有显著性。

　　 结果：

　　 1、人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及genistein对其是否具有抑制作用的研究：成功建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，腹腔注射给药等实验过程顺利，将genistein各剂量组与对照组作比较，genistein低、中、高剂量组移植瘤生长抑制均显著（P<0.05）。 本实验每天给予荷瘤裸鼠不同剂量的genistein连续治疗21天，治疗过程中及治疗后观察荷瘤裸鼠的生长、活动、饮食等一般状态未见明显异常，治疗前、后体重无显著差异（P>0.05）。

　　 2、Genistein对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤组织中cyclinB1和cyclinD1蛋白的表达的影响：Westernblot结果显示，与对照组比较，genistein低、中、高剂量组处理后cyclinB1蛋白表达逐渐下降，cyclinD1蛋白表达逐渐升高，均存在明显的剂量效应关系，有统计学意义（P<0.05）。

　　 结论：

　　 1、Genistein对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤具有抑制作用，呈剂量效应正相关；

　　 2、Genistein下调卵巢癌组织中cyclinB1蛋白表达并上调eyclinD1蛋白表达。