乳腺癌是当今严重威胁全球女性健康的最常见恶性肿瘤之一。膳食、营养因素在乳腺癌的发生和发展过程中起着重要作用。流行病学研究和系统评价的研究结果显示,大豆及其制品的摄入量和乳腺癌的发病风险呈明显负相关。异黄酮(Isoflavones)是一类多酚类化合物,主要活性成分有大豆苷元(二羟基异黄酮,Daidzein)、染料木黄酮(三羟基异黄酮,Genistein)、生物单宁A(BionhaninA)、芒柄花黄素(Formononetin)等。最近的研究发现异黄酮具有调节宿主免疫功能、诱导细胞凋亡、雌激素与抗雌激素、抗氧化和调节细胞信号传导等广泛的生物学作用。

　　异黄酮在乳腺癌预防方面的研究进行了二十多年。起源在于众多流行病学的调查资料发现亚洲人乳腺癌发生率显著低于欧美人,认为亚洲人的膳食中含有大量豆类食物,豆类中的主要活性成分异黄酮发挥了重要作用。异黄酮预防乳腺癌的机制主要有:(1)抑制酪氨酸蛋白激酶的活性和表达;(2)改变生长因子的活性,抑制肿瘤细胞血管新生;(3)抑制酶活性(包括3β-羟基类固醇脱氢酶等);(4)作用于雌激素受体ERα和ERβ。我科室及国外的研究也在异黄酮调控的信号转导通路方面做了一些报道。但其确切的分子机制仍未完全阐明。

　　由于癌症的调控机制通常呈网络状,相互作用紧密联系,通过调节其中一个环节往往难以起到显著作用,迫切需要研究者从新的角度认识异黄酮预防乳腺癌的作用机制。而最近几年对表观遗传尤其是DNA甲基化的报道,可能为我们的研究提供了一个新的思路。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基基团转移到基因组DNA胞嘧啶的第5位碳原子上。DNA高甲基化导致的基因抑制和基因组不稳定性有关,也能使肿瘤抑制基因受到抑制和染色体结构发生改变。在癌细胞中,正常的未甲基化的CpG岛发生的高甲基化,可能导致重要基因的沉默,例如一些肿瘤抑制因子的活性抑制。同时在其他区域的CpG二核苷酸可能变成低甲基化,使正常沉默的基因(例如促癌基因或逆转录转座子)的转录抑制降低。基因的启动子区域发生的甲基化异常是癌变基因表

达异常的重要机制。一些在乳腺癌中经常发生甲基化变异的基因已经被发现和总结。

　　最经典的实验证明异黄酮可以调节哺乳动物的表观基因的是Dolinoy等人为了验证母鼠的膳食摄入可以影响子代小鼠的表观基因状态,采用250mg/kg的染料木黄酮(Genistein)喂食,观察Agouti基因的变化和该基因引起的表型(小鼠毛色)的变化。Agouti基因表达较低时,毛发颜色主要偏向黑色;而Agouti基因表达较高时,毛发颜色偏向浅黄色。结果发现与对照组相比,喂食GEN的母鼠生出的小鼠IAP启动子CpG岛的甲基化水平升高,Agouti基因的表达受到抑制,从而使动物毛发颜色变深,且子代小鼠成年后体型也较瘦。这项表观遗传学上的里程碑式的发现不仅确认了异黄酮作为一种甲基化营养添加剂的重要意义,也表明了环境因素、孕期膳食、营养补充剂等因素可以通过影响基因的表观遗传学状态而改变基因的表达与功能,从而影响疾病的表型。

　　基于以上分析,推测GEN可通过调控DNA甲基化抑制乳腺癌细胞增殖。本研究以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,采用Real-timePCR、MSP等方法,研究了不同浓度和时间的GEN处理下基因组甲基化水平的变化,DNMT表达的变化以及癌症相关基因(ATM、APC、PTEN、MASPIN、14-3-3sigma)的mRNA和启动子甲基化的变化,以期探讨GEN对乳腺癌细胞株的甲基化程度和基因表达的影响。

　　主要实验结果和结论如下:

　　1.细胞活力检测结果显示,GEN处理24h时细胞活力没有明显变化,GEN处理48h和72h时细胞活力被显著抑制(P<0.05),并且100μM的效果比60μM更明显(P<0.05)。结果表明60μM和100μM的GEN对乳腺癌细胞MCF-7活力有明显抑制作用。

　　2.基因组总体甲基化水平的检测结果显示,GEN处理24h后,60μM和100μM均没有明显变化;处理48h后,60μM和100μM使总体甲基化水平明显降低(P<0.05);处理72h后,100μM组比60μM组的总体甲基化降低明显(P<0.05)。该结果提示GEN对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用可能与其降低DNA甲基化水平有关。

　　3.对DNMT的检测结果显示处理24h后,100μM的GEN明显抑制DNMT活性,处理48h和72h后,60μM和100μM的GEN均能使DNMT活性明显降低(P<0.05)。Real-timePCR结果显示处理24h后,60μM和100μM的GEN对DNMT1mRNA没有明显影响,但处理48h和72h后,60μM和100μM的GEN使DNMT1mRNA的表达明显降低(P<0.05)。进一步采用分子对接研究发现GEN能与DNMT1催化甲基化的活性区域结合,抑制其发挥甲基化活性。

　　4.对基因表达和甲基化程度的检测结果显示,GEN对基因mRNA表达和DNA甲基化的改变程度各不相同。研究发现在ATM基因中,60μM和100μM的GEN处理72h使甲基化水平明显降低。在APC、PTEN和MASPIN基因中,只有100μM的GEN使其甲基化水平明显降低,60μM处理时甲基化水平没有显著变化。在14-3-3sigma基因中,60μM和100μM的GEN处理时甲基化水平都没有明显变化。

　　综合分析上述研究结果,表明GEN通过抑制DNMT活性和表达发挥去甲基化作用,使肿瘤抑制基因的启动子甲基化程度降低,重新开放某些特定的肿瘤抑制基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞株MCF-7的增殖。