研究背景与目的:

2013年的最新统计显示全世界女性每一年死于乳腺癌的人数大于癌症总死亡人数的15％，乳腺癌成为女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁全球女性的健康。原发肿瘤病灶包含一般的肿瘤细胞和肿瘤干细胞，肿瘤干细胞具有干细胞的特性，对手术，放化疗不敏感，常规的治疗方法并不能彻底的将其杀死，进而肿瘤预后不佳。乳腺癌干细胞是肿瘤复发、转移、放化疗抵抗的重要原因。以乳腺癌干细胞尤其是乳腺癌干细胞相关信号转导通路为靶点的乳腺癌治疗更为有效和彻底，为临床彻底治愈乳腺癌提供了新的方法和思路。

　　亚洲和欧美国家的饮食结构不同，饮食中的Genistein是导致亚洲，尤其是东南亚地区居民的乳腺癌发病率相对于其他地区明显较低的关键。Genistein是大豆类植物中天然存在的异黄酮类物质，可通过多种信号转导通路作用于癌细胞。而这些信号传导通路同时在乳腺癌干细胞的信号调控中起到重要作用。特别是近期关于Hedgehog(Hh)信号转导通路的研究，提示其异常活化在乳腺癌的发生发展中起到重要作用。

　　本实验目的是探讨Genistein对乳腺癌干细胞的作用及其机制，为治疗乳腺癌提供重要的理论和实验依据，具有重要的临床和病理意义。
方法:

本研究以乳腺癌细胞系MCF-7和裸鼠乳腺癌移植瘤模型作为主要研究对象。采用CCK-8实验测定24小时IC50的Genistein的剂量。分别通过集落形成实验和AV-PI流式细胞分析验证Genistein对乳腺癌细胞的增殖和凋亡的影响。其次进一步通过成球试验定性分析和流式细胞技术检测乳腺癌干细胞表面标记物CD44+CD24-相对定量分析，并且用Western Blot进一步验证乳腺癌干细胞另一重要标记物ALDH1的表达，探讨Genistein对乳腺癌干细胞的作用。

　　裸鼠乳腺癌模型来验证上述体外试验得到的结论。通过比较形成肿瘤的大小，免疫组化检测乳腺癌干细胞标记物ALDH1的表达，验证Genistein小鼠体内试验和体外试验结果。

　　最后蛋白水平应用Western Blot，基因水平应用real-time PCR检测Genistein对实验组的Hedgehog信号转导通路的特异性蛋白和基因的影响。

结果:

　　1.CCK-8法检测Genistein对乳腺癌细胞增殖的影响结果提示:低浓度剂量时Genistein对其抑制作用很弱;较高浓度时抑制作用明显增强。24h其IC50为32.5μg/ml。集落形成试验5μg/ml Genistein的细胞存活分数为81％，10μg/ml即可观察到明显的集落数目的降低;15μg/ml Genistein作用于乳腺癌细胞，基本不形成集落。流式细胞技术检测细胞凋亡，在0、15、30μg/ml Genistein三个实验组早期凋亡率分别为1.50％、18.38％、29.45％。

　　2.乳腺球形成试验结果显示Genistein实验组乳腺球的体积明显低于对照组，数目减少。并且实验组细胞有出现凋亡和坏死。流式细胞仪检测CD44+CD24-细胞的比例:对照组CD44+CD24细胞占总细胞的比例为1.79％。15μg/ml、30μg/mlGenistein实验组CD44+CD24-细胞占总细胞的比例分别为0.93％、0.88％。Western blot检测Genistein实验组ALDH1的表达低于对照组。0、5、10μg/ml Genistein的ALDH1蛋白的表达分别为1.57±0.21、1.02±0.37、0.71±0.43。

　　3.小鼠肿瘤称重，自第一次给药第21天后，0、5、10μg/ml Genistein作用的肿瘤重量分别为2.21±0.72、1.38±0.65、0.84±0.47g。免疫组织化学检测不同浓度Genistein作用小鼠肿瘤后ALDH1的表达，结果显示实验组ALDH1的表达明显下降。

　　4.Western Blot和real-time PCR分别检测蛋白水平和基因水平的Hedgehog信号转导通路关键分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1的表达。结果实验组在蛋白水平和基因水平的表达均显著低于对照组。

结论:

　　1.Genistein可以抑制乳腺癌细胞的增殖，并且促进其凋亡。

　　2.Genistein在体外和体内对于乳腺癌干细胞可能都存在一定的抑制作用。

　　3.Genistein对于乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞均存在一定程度的抑制作用，其作用机制可能是通过抑制Hedgehog信号转导通路而发挥作用的。