【背景】

　　胃癌是我国消化道最为常见的恶性肿瘤之一,局部浸润和远处转移是导致患者死亡的主要原因,目前尚无有效手段阻止这一过程的发生和进展。Genistein是从豆类中提取出来的黄酮类天然小分子化合物,具有抗氧化以及高浓度下阻滞细胞周期的作用。流行病学调查以及基础和临床研究结果表明,Genistein可以抑制前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等多种肿瘤的浸润和转移能力。目前,关于Genistein是否影响胃癌细胞的侵袭转移能力尚未见报道。

　　由于Genistein在结构上与17-β-雌二醇类似,因此在临床应用过程中会出现类雌激素样副作用,如血压波动,面部潮红等。另外,Genistein在大剂量使用的时候其非特异性杀伤作用会引起骨髓抑制。这些副作用都限制了它的广泛应用,为此我们课题组前期对Genisteinn各个分子集团的功能进行了替代研究,明确了其功能,并在此基础上合成了一个新的化合物KBU2046。在前列腺癌中的体内外研究结果表明KBU2046与Genistein具有等效或更强的抑制肿瘤转移的作用,但其雌激素样和骨髓抑制副作用显著下降。

　　肿瘤的转移是一个多步骤、多阶段的级联事件,但是目前研究肿瘤转移的方法和模型,如划痕实验,Transwell实验,裸鼠尾静脉转移模型等往往只能模拟转移级联事件中某一阶段的情况。原位转移模型可以模拟人体内肿瘤的局部增殖、脉管侵入和远处定居,明显优于上述常用方法,值得探索。

【目的】

　　通过体内外实验系统地研究Genistein及其改构体KBU2046对胃癌细胞侵袭转移能力的影响,通过PCR Array技术初步筛选Genistein和KBU2046发挥作用的分子机制。最后,探索建立胃癌原位转移的动物模型,为将来开展动物实验奠定基础。

【方法】

　　(1) MTT方法检测Genistein和KBU2046对胃癌细胞杀伤能力的影响,采用流式细胞术观察Genistein和KBU2046对胃癌细胞周期和凋亡的影响,从而确定安全无毒的药物浓度。

　　(2) Transewell实验评价Genistein和KBU2046对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;采用细胞高内涵平台动态观察Genistein和KBU2046对胃癌细胞迁移的影响。

　　(3)采用PCR Array技术检测Genistein和KBU2046处理后胃癌细胞内分子表达的变化,筛选Genistein和KBU2046可能作用的分子通路;采用实时荧光定量PCR和Western blot技术对候选分子进行验证。

　　(4)建立Luciferase标记的胃癌细胞裸鼠尾静脉转移模型,采用活体小动物成像仪观察灌胃给予Genistein对胃癌肝肺转移灶形成的影响(本研究对于新药KBU2046只做了体外实验,由于想进一步探究较好的动物模型,故尾静脉裸鼠转移模型中尚未使用KBU2046灌胃)。

　　(5)建立胃癌原位转移的动物模型:首先建立胃癌裸鼠的皮下成瘤动物模型,待肿瘤长到足够的体积后手术切除,将获得的肿瘤组织切成小块后缝合固定于胃大弯前壁的浆肌层。三周后开始每周处死三只裸鼠,切去动物胃、肝和肺组织进行成像,并做组织病理切片,评价建模是否成功以及肝肺转移度。(本模型拟用于进一步研究药物在原位模型的效果)

【结果】

　　(1) KBU2046较 Genistein细胞毒性小,安全剂量窗口大。我们评价了KBU2046和Genistein作用24h和72h对胃癌细胞和永生化胃黏膜上皮细胞增殖能力的影响,发现KBU2046在高达50μM的浓度时作用24h后,对胃癌细胞和永生化胃黏膜上皮细胞的增殖仍无明显影响;而当 Genistein浓度高于25μM时作用24h即对胃癌细胞系增殖产生了明显抑制,高于12.5μM时作用72h对胃癌细胞和永生化的胃黏膜细胞的增殖均产生了明显抑制。综合考虑,选用KBU2046和Genistein10μM的药物浓度进行后续实验。10μM KBU2046和Genistein处理胃癌细胞MKN28M、MKN28NM、MKN45以及永生化胃黏膜细胞GES72h对细胞凋亡无明显影响,证明该药物浓度是无细胞毒性的。

　　(2) Transwell实验及细胞高内涵实验结果表明KBU2046和Genistein可以显著抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力,而对永生化胃黏膜细胞无明显影响。

　　(3)在PCR Array检测的120多个转移相关基因中,Genistein处理组表达变化2倍以上基因12个,KBU2046处理组表达变化2倍以上基因9个,结合文献报道我们选取了其中的MMP2、MMP7、IGF1和CTSK在mRNA水平进行了定量PCR验证,发现Genistein和KBU2046处理均可使其表达下调,其中以MMP7最为明显。Western blot证实MMP在蛋白表达水平也明显下调。

　　(4)在裸鼠尾静脉转移模型中,25mg/kg和75mg/kg Genistein灌胃6周后,活体小动物成像结果显示药物处理组转移信号明显低于对照组,且75mg/kg组抑制转移效果优于25mg/kg组,上述两药物浓度对裸鼠体重均无明显影响。

　　(5)原位种植肿瘤信号随时间进展逐渐增强,HE染色显示原位肿瘤位于胃黏膜层和浆膜层中间。通过成像技术发现第4周起肺上出现转移信号,肝上未见转移信号,裸鼠处死后 HE染色在肺上见明显转移灶而肝上未发现转移灶。

【结论】

　　本研究通过体内外实验系统研究了 Genistein及其改构体 KBU2046对胃癌侵袭转移能力的影响。发现两者在低浓度时可以在不影响细胞增殖和凋亡的情况下降低胃癌细胞的侵袭转移能力。机制研究发现,Genistein和KBU2046处理可以使胃癌细胞内多个转移相关基因表达下调,其中以MMP7变化最为明显,表明二者可能通过抑制MMP7表达而发挥抑制胃癌细胞侵袭转移的作用。同时,我们成功建立了胃癌的裸鼠原位移植模型,并在肺上观察到了转移病灶,提示该模型可在将来可作为研究药物处理影响胃癌细胞转移的模型。