一、Gneistein抗恶性细胞增殖的机理 
有效的抗肿瘤药物可能作用于细胞增殖过程的不同环节，包括：（1）核酸代谢和DNA合成，如烷化剂、核昔酸类似物及抗代谢化合物；（2）DNA复制、转录及翻译，如DNA拓扑异构酶抑制剂;（3）有丝分裂过程和染色体行为，如作用于微管蛋白的化合物;（4）生长、激动信号的传导通路，如蛋白激酶抑制剂、法尼基蛋白转移酶抑制剂等。这些药物可以直接杀死恶性细胞，或者引起恶性细胞增殖的停滞。药物对恶性细胞增殖的影响常常是多方面的。 
Gneistein的结构与雌激素结构相似，在低浓度下表现出雌激素样作用，刺激激素依赖性乳癌细胞的生长[1]；并能与17-β雌二醇竞争性结合雌激素受体，是雌激素受体的部分拮抗剂[2]。我们用MTT分析表明，genistein不仅抑制依赖于雌激素受体的细胞如MCF-7的生长，也抑制其它不依赖雌激素受体的、不同组织来源的恶性细胞（包括人上皮癌、结肠癌、卵巢癌、肝癌、纤维肉癌）的生长，而且还对柔红霉素和紫杉醇抗性的KB细胞有较强的生长抑制作用。Gneistein拮抗雌激素的作用显然不是其抗恶性细胞增殖的主要原因。 
Genistein是蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的强抑制剂，竞争性抑制ATP与PTKs的结合，体外实验表明能抑制各种PTKS，如c-src、v-bal以及EGF受体，抑制这几种PTKs的半数浓度分别为7.4、22.2和2.6μM。PTKs在癌发生以及恶性增殖的调控中起着重要作用，因为多种控制细胞生长的因子如EGF、PDGF、胰岛素等的细胞膜受体均具有PTK活性，而且许多癌基因的产物如Scr家族膜蛋白都是PTKs。但是，在远大于有效抑制细胞增殖的IC50(5-40μM)的浓度下，genistein并不抑制细胞内EGF受体和胰岛素受体[3,4]的自身磷酸化，也不引起这些激酶的蛋白底物酪氨酸磷酸化水平的明显变化；111μM genistein并不能明显阻滞PDGF受体、神经生长因子受体介导的生长激动信号的传导[5,6]。我们在研究中也曾经观察到，100 μM genistein不影响EGF刺激的受体自磷酸。造成genistein在细胞水平上抑制PTKs能力较低的原因可能有：（l）细胞内ATP浓度较高；（2）genistein难以有效进人细胞[7]，或者genistein在细胞内被代谢，难以达到足够的抑制浓度。尽管如此在较低浓度下，genistein仍有可能引起细胞内微弱的蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化，这种变化也许用现有的实验手段(包括[32P]标记和抗体识别)还检测不出来；这种微弱的蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化可能影响到信号通路的下游靶点，影响生长调控的信号通路，因而影响恶性细胞的增殖。已经有研究发现genistein可能影响到受体型PTKs的下游靶点，如:核糖体S6激酶[8]、MAP激酶等；这些下游靶点可以直接影响到转录因子的活性，引起基因表达的改变。Gnestiein可以抑制PDGF诱导的立即早期基因(inunediate early gene)c-jun和c-fos表达[9]，抑制PAF诱导的c-fos基因表达[10]。我们在研究中也发现，用20μM和30μM genistein处理B16-BL6黑色素瘤细胞可以引起细胞内P53蛋白和c-Myc蛋白含量的改变。也许genistein诱导的P53和myc基因的改变不能完全归因于genistein对PTKs的抑制，但是有理由相信，gneisteni对PTKs及激动信号的传导通路的抑制作用是genistein抗恶性细胞增殖的一个重要原因。 
DNA拓扑异构酶参与基因转录和重组、细胞核DNA复制以及染色体在有丝分裂后期的分离等多种核内过程，催化DNA拓扑构象的相互转换。Gneistein是DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)的抑制剂，可以通过与ATP竞争性结合TopoⅡ而表现出对TopoⅡ活性的抑制作用[11]。genistein抑制TopoⅡ的IC50为l1lμM，但在11.1μM时即能明显抑制TopoⅡ对P4噬菌体DNA的解结节作用(unknotting)，而在3.7μM时也可明显提高L1210细胞中TopoⅡ-DNA复合物的量[13,14]，我们的实验也发现，1μM genistein能够引起TopoⅡ诱导的线性DNA分子的增加:当浓度增高时，线性分子增加明显，100μM genistein能引起线性分子的显著增加。出现这一结果的原因是gneisteni对形成的ToPoⅡ-DNA复合物具有稳定作用，在较低浓度下gnestiein诱导线性DNA分子的增加，表明genistein可以阻断DNA复制时由于TopoⅡ作用所引起的断裂DNA的重新连接，造成细胞内DNA碎片的出现，引起细胞生长阻滞或死亡.这一作用与鬼臼毒素类细胞毒药物的作用相似，只是由于gneisteni对TopoⅡ的这一作用（DNA拓扑异构酶Ⅱ毒剂，DNA topoisomeraseⅡPoison）相对较弱，因此genistein抑制TopoⅡ的最终结果可能更多地不是表现为细胞死亡，而是表现为细胞功能和性质的改变（如发生分化），或者细胞生长抑制，这是gneisteni抗细胞增殖作用的一个重要特点。目前还不清楚TopoⅡ抑制剂在抑制细胞TopoⅡ活性后是如何引起细胞死亡或生长阻滞的，但发现VM-26及etniposide作用细胞后能迅速诱导立即早期基因c-jun的表达，在这以后细胞内才出现180-20bp的DNA碎片[15]，这是细胞程序性死亡的典型特征。合理的推论是：抑制TopoⅡ造成DNA损伤后可引起另外一些与DNA损伤或细胞周期调控有关的基因的表达，如p53[15]；这些基因的表达引起细胞周期阻滞在G2期，最终将造成细胞坏死或凋亡。我们在实验中发现，gneistein能够诱导B16-BL6黑色素瘤细胞P53蛋白含量的显著增高。 
P53基因突变对于大多数肿瘤的发生都具有重要意义.P53是一种DNA结合蛋白，能结合在一种特异的GADD45基因(growth-arrest DNA-dmaage-inducible gene)上，产生一种引起G1阻滞的蛋白[16]，p53也是一种可与蛋白结合的蛋白，能通过与其它蛋白的作用影响基因的转录，或者识别损伤DNA[17]。p53蛋白的作用有：（l）诱导已发生DNA损伤的细胞凋亡；（2）通过促进细胞周期阻滞因子（如P21)活性，将细胞周期阻滞在G1期或G2期。有实验表明，gnestiein能使细胞周期阻滞在G2-M期[18,19]。可以认为，genistein诱导恶性细胞P53蛋白含量的增高可造成细胞周期阻滞，进而抑制细胞的增殖。我们的实验表明，genistein可以诱导人早幼粒白血病细胞的程序性死亡。虽然我们没有在同一实验中对p53基因的表达进行检测，但我们认为，gnestiein抑制TopoⅡ活性并造成细胞内DNA损伤后可以诱导p53基因的表达，p53基因表达的增高是诱导程序性细胞死亡的重要原因之一。在NB4细胞中，我们检测到bcl-2基因表达随着程序性细胞死亡的发生而明显减弱。Bcl-2蛋白可与Bax蛋白结合，阻止Bax/bax二聚体形成，抑制程序性细胞死亡[20]。Bcl-2基因表达的降低是gnestiein诱导NB4细胞程序性死亡的另一重要原因。 
总之，从genistein生物化学、药理学性质以及对我们实验结果的分析来看，genistein抗恶性细胞增殖作用可能同时依赖于其对PTKs和TopoⅡ活性的抑制。genistein对PTKs的抑制将阻断生长激动信号的传导，对TopoⅡ活性的抑制则产生损伤的DNA，两者的结果最终是相同的，即改变基因（如P53和bcl-2）的表达，一方面可以诱导细胞周期阻滞和细胞生长抑制，另一方面则诱导细胞的程序性死亡.
二、Gneistein诱导恶性细胞分化的机理与细胞骨架相关蛋白酷氮酸磷酸化 
细胞骨架结构在维系细胞形态、生长、分化以及细胞内物质转运和分泌功能中都起着重要作用。细胞的癌变往往伴随细胞骨架超微结构以及功能的改变；而细胞骨架蛋白的酪氨酸磷酸化的改变被认为与表型的转化明显相关。在多种类型肿瘤中往往能检查到PTKs活性的增强以及蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高，如即pp60c-sre、Ick以及c-Yes活性在结肠癌细胞中往往高于粘膜细胞[21,22,23]在来源于头颈部癌的一些细胞系中也普遍存在着蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高[24]。有研究表明，PTKs活性往往与细胞骨架蛋白相关，如在血小板聚集时pp60c-sre迅速移位到细胞骨架附近[25]，在粘附斑形成时，FAK也迅速靠近细胞骨架结构[26]。 
与细胞骨架结构相关的PTKs影响着细胞的分化性质。突出的例子是鸡胚肠的发育研究表明，腺泡干细胞(cyrpt stem cell)中酪氨酸磷酸化蛋白含量比分化的肠绒毛细胞要高出15倍，这些磷酸化蛋白分布在Triton不溶的细胞骨架组分中[27]；腺泡细胞中细胞骨架相关的pp60c-sre的活性也高于分化的肠细胞[28]。这些研究提示，胞骨架相关的PTKs活性以及细胞骨架相关蛋白的酪氨酸磷酸化水平的降低可以引起细胞分化。 
我们的研究表明，用gneistein处理B16-BL6黑色素瘤细胞3天后，能够引起细胞形态、细胞骨架以及超微结构的明显变化，诱导酪氨酸酶活性增强、黑色素含量增加，细胞的软琼脂克隆形成率和增殖速率明显隆低。这些变化都提示genistein诱导B16-BL6细胞发生了明显的分化。用TritonX-100抽提和分级离心的方法从B16-BL6细胞裂解液中获得细胞骨架相关组分和胞浆组分，进而用Western blot分析检测酪氨酸磷酸化蛋白，结果发现，用genistein处理后黑色素瘤细胞的细胞骨架相关蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显降低，其中变化明显的包括分子量在6OkDa左右的蛋白的酪氨酸磷酸化水平。这一结果与Shwartz et al的结果一致；这些作者在用丁酸钠、8-cl-cAMP以及tyrphostins处理人结肠癌细胞LS174T、COLO205、SW620后，发现在碱性磷酸酶活性升高和细胞分化的同时，细胞骨架相关的PTKs的活性明显降低。genistein是PTKs抑制剂，用它处理B16-BL6细胞后可引起细胞内某些PTKs活性的下降，这些PTKs活性的降低影响着细胞骨架相关蛋白的酪氨酸磷酸化，引起细胞骨架结构及功能的变化，从而影响到细胞的形态、分泌功能以及分化性质。我们在研究中也看到，genistein能引起细胞骨架蛋白排布和细胞形态的明显变化，分化的细胞向培养基中分泌黑色素的功能也明显增强.因此可以认为，PTKs抑制剂genistein引起的细胞骨架相关蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低是它诱导B16-BL6细胞分化的重要原因之一 
三、Genistein抗侵袭转移的机理及粘附诱导的蛋白酪氮酸磷酸化 
恶性细胞的侵袭转移是一个复杂的过程。虽然目前对侵袭和转移过程还没有详细阐明，但一般认为，恶性细胞从原发部位浸润、转移和扩散到远处器官和组织，涉及以下一些环节：（1）恶性细胞同质粘附力降低，恶性细胞粘附于基质膜，分泌或激活基质蛋白酶（包括基质金属蛋白酶），运动并穿过被降解的基质进人周围组织，即所谓的恶性侵袭过程；（2）恶性细胞侵袭穿过血管内皮下基底膜，进人血液循环；（3）恶性细胞在循环中被动运输，逃避免疫监控，粘附于靶器官血管内皮细胞和内皮下基底膜；（4）恶性细胞侵袭穿过血管内皮基底膜，进人远处的靶器官；（5）转移和侵袭的恶性细胞在靶器官中克隆生长，诱导新血管生成，促进转移灶形成[29]。有效阻止恶性细胞的侵袭和转移可以从抗侵袭、增进机体免疫监控机能、抗粘附以及抑制血管生长等几个方面人手。 
我们用重组基质膜体外侵袭模型表明，genistein是一个有效的抗恶性侵袭化合物，能够有效抑制人纤维肉瘤HT1080细胞以及小鼠黑色素瘤B16-BL6细胞的恶性侵袭。这一作用不仅能在较高浓度即100μM下达成，而且也能在较低浓度如20μM时表现出来。由于genistein突出的抗恶性侵袭作用，我们在动物实验中观察到genistein对恶性细胞实验性肺转移的抑制作用，发现genistein能延缓转移模型小鼠的死亡，表现出显著的抗转移作用。Genistein抗侵袭作用是其抗转移的主要原因。 
Genistein抗恶性侵袭作用与其影响恶性细胞侵袭相关性质密切相关。与恶性侵袭相关性质包括：恶性细胞与细胞外基质的粘附能力、恶性细胞的趋化运动能力以及恶性细胞分泌或激活基质蛋白酶的能力[30]。其中，恶性细胞分泌或激活基质蛋白酶的能力被认为与恶性侵袭和转移明显相关。例如，在前列腺癌、非小细胞肺癌和乳癌等肿瘤中MMP-2和MMP-9的表达与肿瘤的恶性程度表现出很好的相关性[31,32,33]，其它一些基质金属蛋白酶如MMP-l（interstinal collagenase)、MMP-7(matrilysin，PUMP-l)在头颈表皮样癌及前列腺癌和乳癌中都有较高水平的表达[34]。我们的实验表明，genistein能够明显抑制HT1080细胞和B16-BL6细胞的趋化运动，但对细胞与ECM的粘附不产生明显影响。实验还表明，genistein较为显著地抑制MMP-2和MMP-9的激活，使HT1080细胞培养上清液中激活的MMP-2和MMP-9的含量分别降低46%和65%。由于基质金属蛋白酶往往是以无活性的酶原形式分泌到细胞外，所以在评价药物抗侵袭作用时，评价药物对细胞激活基质金属蛋白酶作用的影响比单纯评价药物对细胞分泌基质金属蛋白酶的影响要重要得多。由于某些宿主细胞（如基质细胞和成纤维细胞）往往也能分泌基质蛋白酶，而有些恶性细胞如B16-BL6黑色素瘤细胞并不分泌基质金属蛋白酶，所以在更多的病理条件下，恶性细胞也许只是分泌某些诱导因子或激活因子来诱导或激活宿主组织产生基质蛋白酶.目前对于基质金属蛋白酶激活的生理机制还不清楚。基质金属蛋白酶的激活可能依赖于恶性细胞表面存在的一些膜因子，如[MMP-1]

（membrane-type matrix metalloproteinase，MT-MMP）[35,36]。我们的研究表明，genistein显著抑制基质金属蛋白酶的激活，因而抑制恶性细胞降解细胞外基质，进而有效抑制恶性细胞的侵袭。我们用Northern blot分析发现，genistein能诱导HT1080细胞TIMP-l的表达量增加2倍。TIMP-1是基质金属蛋白酶的抑制剂，能与基质金属蛋白酶（主要是MMP-9）的C-末端结合，有利于基质金属蛋白酶形成一种“Zn2+开关” (znic switch)结构，掩饰酶活性中心，有效抑制基质金属蛋白酶活性[37]。Genistein诱导TIMP-1表达增加可能是其抑制基质金属蛋白酶激活的重要原因。 
目前，对于恶性侵袭和转移发生的最初始原因还不清楚。从现有的研究来看，细胞外基质信号可能是诱使恶性侵袭发生的初始原因之一。恶性侵袭的最初始步骤是癌细胞与ECM的粘附。有研究表明，细胞与ECM粘附及其相互作用能诱导细胞内蛋白酪氨酸磷酸化，启动信号传导通路[38,39]。这种粘附诱导的蛋白酪氨酸磷酸化伴随着粘附斑形成、细胞骨架重建以及侵袭足形成[40]，并能诱导基质金属蛋白酶产生[41]。这些研究提示，细胞与ECM粘附所诱导的ECM信号传导可能是侵袭发生的最早期事件之一。ECM信号主要通过细胞表面整合素(integrin)介导，这是一类粘附分子受体家族，由α、β两个亚基形成异二聚体，形成20种左右的整合素分子[42]。细胞外基质与整合素分子结合，能引起整合素分子在细胞表面重新分布和聚集；整合素分子的聚集引起FAK的激活，这种位于粘附斑的蛋白酪氨酸激酶激活后就能与Src蛋白作用，并进而通过Grb2/SOS及Ras等中间分子，将细胞外基质粘附信号传递到GAP蛋白或MAPK，前者将引起细胞骨架结构的改变并促进形成粘附斑和侵袭足，MAPK则能将信号传递到细胞核内引起基因表达的改变 [43]（图40）。由此推测，抑制粘附诱导的蛋白酪氨酸磷酸化以及ECM信号传导将能有效地改变侵袭相关性质，抑制恶性细胞的侵袭和转移。我们在B16-BL6细胞中看到，genistein能够明显抑制由于细胞与ECM粘附而诱导产生的蛋白酪氨酸磷酸化，这些被磷酸化的蛋白分布在细胞周缘粘附斑区域，其中包括FAK。抑制粘附诱导的蛋白酪氨酸磷酸化的有效浓度与抑制B16-BL6细胞侵袭的有效浓度一致。同样，当B16-BL6细胞用genistein处理3天侵袭和转移能力明显降低时，粘附Matrigel所诱导的蛋白酪氨酸磷酸化水平也明显降低。我们的结果表明，抑制粘附诱导的蛋白酪氨酸磷酸化是genistein抗侵袭和抗转移的重要机制之一我们的结果还提示，抑制粘附诱导的蛋白酪氨酸磷酸化、干扰癌细胞与ECM相互作用是抑制恶性细胞侵袭和转移的有效策略之一。 
四、Genistein癌化学预防作用的机理探讨 
癌的发生包括始发突变、促癌、演进三个阶段。由于物理或化学因素造成正常细胞基因突变，基因突变积累以及促癌因子对突变细胞的选择性克隆最终演进、发展成癌细胞群体。造成始发突变的因子常常是一些化学致癌剂，这些致癌剂直接或间接经代谢活化后具有亲电子特性，能够与细胞DNA特异性靶点共价结合，形成的“前突变物”一旦逃避细胞内DNA修复系统的作用，就能够引起基因的突变，引起原癌基因活化、抑癌基因失活以及细胞表型出现明显变化，形成所谓的“始发突变细胞”。促癌剂如TPA的作用在于促进始发突变细胞的选择性克隆增殖，产生并累积新的遗传改变。癌化学预防药物主要表现为抗始发突变和/或抗促癌作用，其中包括抑制致癌剂活化、提高解毒和排出致癌物能力、阻断致癌剂。DNA加成物形成、提高机体DNA损伤修复能力、拮抗促癌剂引起的多种生物学效应等。 
我们用Balb/3T3-A31细胞体外二阶段转化模型研究了genistein对细胞恶性转化的影响，发现genistein显著抑制3-甲基胆蒽、TPA对Balb/3T3-A31细胞的转化作用，抑制恶性转化灶的形成；在所用的最小浓度即2.25μM下抑制转化作用仍很明显，说明genistein具有良好的癌化学预防作用。 
Genistein不是有效的抗突变化合物，对苯并花诱发的鼠沙门氏菌TA100突变只有中度的拮抗作用[44]，但genistein对P450介导的苯并花活化有较强的抑制作用[45]。有些作者提出，genistein的癌化学预防作用与genistein的抗氧化性质有关[46,47]。活性氧自由基在癌变、尤其在促癌过程中起着重要作用；活性氧自由基可引起组织坏死、细胞脂质过氧化以及对大分子（如DNA）氧化修饰，引起DNA链断裂或碱基改变[47]，这些变化都与促癌过程有关。虽然genistein能抑制TPA诱导的体内外H2O2的生成[46]，但是genistein的抗氧化作用并不强。我们的实验表明，100μM genistein对过氧脂质自由基O2–、-OH都只有很微弱的清除作用。Jha et al也报道genistein对Fe2+/ADP复合体与NADPH产生的脂质过氧化的抑制作用很弱，半数抑制浓度高达500μM。这么高的浓度在生理条件下是无法达到的。因此，我们认为，genistein抗氧化作用不是其癌化学预防作用的主要机制。 
TPA是最常用的促癌剂，可诱发与促癌有关的广泛的生物学效应，这些效应包括诱发细胞产生致炎物（如前列腺素、花生四烯酸等）以及产生大量活性氧自由基；TPA的生物学效应还表观为促进一些细胞的终末分化，或者促进细胞的增殖。TPA的这些生物学效应是通过诱导PKC活性而引起的.PKC是TPA的细胞内受体，当它与TPA特异性结合并被激活后，从细胞质中向质膜转移，磷酸化各种蛋白因子，由此引发一系列的生物学效应.蛋白磷酸化作用是TPA及PKC诱发的最初始的效应之一我们的研究表明，TPA能够促进Balb/3T3细胞的增殖。TPA的这种促增殖作用在Balb/3T3细胞恶性转化中起着关键作用。TPA促增殖作用与其促进ODC基因表达的作用一致。ODC是由PKC修饰的关键酶之一，是多胺生物合成途径的限速酶。多胺对细胞有丝分裂和增殖有促进作用。TPA对ODC的诱导是其引起的早期的细胞内反应之一我们的研究表明，genistein能抑制TPA促进的细胞增殖，并显著抑制TPA对ODC基因表达的诱导作用。Genistein虽然也能抑制PKC，但活性很弱，IC50大于370μM。推测genistein可能作用于MAPK。MAPK是多种生化信号的参人位点[48]，抑制这一蛋白激酶的酪氨酸残基的磷酸化能够影响这一激酶的活性，并进而影响多种基因调控的反式元件（如血清反应因子）的作用，引起基因表达的改变和生物学性质的改变。不论genitein是通过何种机制来拮抗TPA诱导的生物学效应，我们认为，genistein癌化学预防作用的主要环节是在促癌阶段，genistein拮抗TPA促进的细胞增殖、ODC基因表达以及其它生物学效应是其癌化学预防作用的主要机制。 
五、Genistein抗恶性肿瘤的机理(总结)
我们的研究表明，genistein具有以下四个方面的作用：（1）抑制恶性细胞的生长，诱导恶性细胞的程序性死亡；（2）诱导恶性细胞分化；（3）抑制细胞的恶性转化；（4）抑制恶性细胞的侵袭和转移。genistein主要通过抑制TopoⅡ活性以及抑制PTKs活性发挥上述抗恶性肿瘤作用。Genistein对TopoⅡ活性的抑制将能在细胞内造成DNA损伤，引起基因表达的改变，如：p53表达增高，引起细胞周期阻滞和细胞生长抑制；bcl-2表达下降，引起程序性细胞死亡；c-myc以及其它一些分化相关基因表达改变引起细胞分化.另一方面，genistein还通过抑制PTKs，抑制细胞内蛋白酪氨酸磷酸化，引起至少以下四个方面的作用：（1）阻断激动信号的传导，改变基因表达，引起细胞生长抑制或程序性细胞死亡；（2）引起细胞骨架相关蛋白酪氨酸磷酸化水平降低，诱导恶性细胞分化；（3）抑制TPA促进的ODC表达，拮抗TPA促增殖作用以及促癌作用，有效抑制细胞的恶性转化；（4）抑制粘附诱导的蛋白酪氨酸磷酸化，阻断恶性细胞与ECM相互作用，影响侵袭足形成和转移相关性质，抑制恶性细胞的侵袭，并发挥抗转移作用(图41)。 
            

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